Основные фазы роста микроорганизмов

ГЛАВА 8. РОСТ МИКРООРГАНИЗМОВ

Обмен веществ в микробной клетке сопровождается биосинтезом белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и других соединений. В результате этих процессов увеличиваются размеры и биомасса клетки, что определяется как рост. Увеличение численности клеток в процессе их деления называют размножением. Интенсивность роста определяется путем деления биомассы на численность клеток в единице объема через определенные промежутки времени.

Бактерии, размножающиеся в замкнутом объеме питательной среды, представляют собой микробную популяцию. В лабораторных условиях и на производстве микробные популяции культивируют периодическим или непрерывным методом.

8.1. ПЕРИОДИЧЕСКОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ. КРИВАЯ РОСТА

Периодическим культивированием называют размножение микроорганизмов в замкнутом объеме питательной среды. Если в процессе культивирования в среду не добавлять питательные вещества и не выводить продукты жизнедеятельности, то рост микроорганизмов будет продолжаться лишь до тех пор, пока содержание какого-либо компонента не будет исчерпано. Рост микроорганизмов в такой замкнутой системе подчиняется определенным закономерностям и описывается так называемой «кривой роста», выражающей зависимость логарифма числа клеток от времени культивирования (рис. 23).

Рис. 23. Кривая роста микробной популяции в периодических условиях

На типичной кривой роста можно различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности:

• I — лаг-фаза (или фаза задержки роста);

• II — экспоненциальная (или логарифмическая);

• III— стационарная;

• IV — фаза отмирания.

Лаг-фаза охватывает промежуток времени от момента внесения инокулята (посевного материала) до начала размножения микроорганизмов. Во время лаг-фазы число клеток или совсем не увеличивается, или нарастает очень незначительно. Задержка роста в начале лаг-фазы объясняется адаптацией к новым условиям. Тем не менее этот период характеризуется повышенной метаболической активностью: в клетках возрастает содержание РНК и общего белка, синтезируется ряд ферментов. Наблюдается заметное увеличение размеров клеток — они в 3— 5 раз больше обычных. Длительность лаг-фазы зависит от вида микроорганизма, состава питательной среды, количества и возраста вносимого инокулята. Лаг-фаза сокращается при использовании полноценной среды и молодого инокулята.

Иногда в периодической культуре может наблюдаться наличие двух лаг-фаз — диауксия. Это явление двухфазного роста в 1942 г. впервые описал французский ученый Жак Моно на примере поочередного использования двух разных углеводов кишечной палочкой. При культивировании кишечной палочки на среде, содержащей глюкозу и сорбит, клетки сначала потребляют глюкозу, тогда как синтез ферментов, необходимых для расщепления сорбита, подавляется. Эти ферменты синтезируются лишь после того, как вся глюкоза будет израсходована.

Экспоненциальная (или логарифмическая) фаза характеризуется максимальной и практически постоянной скоростью роста клеток. Число клеток в этой фазе возрастает в геометрической прогрессии. В этой фазе рост культуры сбалансирован: питательные вещества субстрата и продукты жизнедеятельности не лимитируют размножение микроорганизмов.

В экспоненциальной фазе роста, длительность которой для многих культур микроорганизмов на жидких средах невелика, питательные вещества быстро потребляются, накапливаются вредные продукты обмена, снижается интенсивность синтеза внутриклеточных компонентов. Все это приводит к замедлению роста культуры и переходу ее в следующую фазу — стационарную.

Стационарная фаза соответствует периоду, когда число жизнеспособных клеток, достигнув максимума, перестает увеличиваться. Многие клетки еще продолжают делиться, но количество вновь образующихся клеток равно количеству погибающих. При этом общая численность микробной популяции не изменяется. К концу стационарной фазы условия роста продолжают ухудшаться и культура переходит в завершающую фазу.

Фаза отмирания характеризуется массовой гибелью микробных клеток. Скорость гибели клеток намного опережает скорость их деления. В сложившихся неблагоприятных условиях выживают лишь единичные особи, появляются так называемые инволюционные формы, не дающие потомства.

Особенности периодического культивирования

Различают два основных способа культивирования микроорганизмов — периодическое и непрерывное. При периодическом культивировании клетки помещают в закрытый сосуд определенного объема, содержащий питательную среду, и задают начальные условия. Развитие культуры приводит к постепенной смене условий существования микроорганизмов: увеличивается плотность популяции, снижается концентрация питательных веществ и накапливаются продукты обмена. Периодическую культуру можно рассматривать как замкнутую систему, которая проходит разные фазы своей жизни (рис. 5.5, а).

Рис. 5.5. Типичные кривые роста:

а — при периодическом культивировании; б — диауксия на среде, содержащей два доступных питательных субстрата

Каждая фаза характеризуется определенными физиологическими параметрами. Лаг-фаза — это фаза «привыкания» клеток к среде, при этом происходят увеличение количества ДНК и РНК и индукция синтеза соответствующих ферментов. Лаг-фаза удлиняется, если брать старый посевной материал и переносить клетки в совершенно новую по составу среду. Лаг-фаза сокращается (или может совсем отсутствовать), если активные молодые клетки перенести в свежую среду того же состава и той же температуры. На средах, содержащих смесь субстратов, наблюдается диа- уксия, при которой после исчерпания одного субстрата культура переходит во вторую лаг-фазу для подготовки к потреблению другого субстрата (рис. 5.5, б). В экспоненциальной (логарифмической) фазе клетки растут и делятся с максимальной скоростью, их рост не ограничен. Обычно такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях. По мере исчерпания субстратов и накопления продуктов обмена скорость роста снижается (наступает фаза замедления роста) и культура переходит в стационарную фазу, в течение которой процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии, когда процессы деления и отмирания клеток в популяции уравновешены. Для бактерий эта фаза достигается при концентрации в среднем 109 клеток/мл, для водорослей и простейших — 106 клеток/мл. Когда исчерпание питательных веществ и накопление продуктов метаболизма достигают неких пороговых концентраций, начинается фаза отмирания и число клеток в популяции постепенно снижается. Фаза отмирания обычно тоже имеет логарифмический характер.

Для проведения расчетов р принимались некоторые допущения, при которых скорость изменения плотности клеток в саморазмножающейся системе пропорциональна самой плотности, т.е. изменение в экспоненциальной фазе роста следует кинетике реакций первого порядка. Тогда

Периодическое культивирование

В процессе культивирования микроорганизмов периодическим способом, как указывалось ранее, можно выделить несколько периодов роста (рис. 2.19).

В первый период, после внесения в среду посевного материала (лаг-фаза), происходит процесс приспособления посевной культуры к новой среде. Численность популяции в эта время не увеличивается (а в некоторых случаях даже снижается). Состояние популяции в лаг-фазе формально можно описать так:

(для т, лежащего между 0 и т1).

Предполагается, что в период лаг-фазы микробные клетки не потребляют субстрата, но метаболическая активность клеток проявляется в повышении содержания белка и РНК (при постоянстве содержания ДНК), а также в увеличении объема клеток, который в общем виде может быть выражен с помощью уравнения

По достижении определенных соотношений между величинами поверхности клетки и ее объема происходит деление клетки, вследствие чего численность популяции начинает увеличиваться с возрастающей скоростью, которая для данной фазы роста культуры, называемой переходной, описывается соотношением

Интегральная зависимость, описывающая участок кинетической кривой роста между т1 и т2, имеет вид

Увеличение скорости роста популяций в переходной фазе идет до предела, определяемого формально достижением параметром ф величины, равной единице, после чего скорость роста начинает выражаться зависимостью

(для т между т2 и т3), откуда интегральная форма представляет экспоненциальную функцию

Эта фаза роста носит название экспоненциальной, или фазы логарифмического роста. Для оценки скорости роста биомассы часто пользуются величиной удельной скорости роста u.

В качестве характеристики растущей культуры, находящейся в этой фазе, используют термины «время удвоения» и «время генерации» q, рассчитываемое по уравнению

Однако такой характер роста популяции, который в первом приближении может быть описан экспоненциальной зависимостью, наблюдается в течение ограниченного периода времени, так как по мере увеличения биомассы все отчетливее проявляется тенденция к замедлению скорости роста. Для такого участка кинетической кривой роста популяции, называемого фазой затухающего роста культуры, может быть использовано дифференциальное уравнение для скорости роста

и его интегральная форма для описания изменения концентрации биомассы во времени

(для интервала времени между т3 и т4).

Снижение скорости роста по мере приближения X к значению Х4 происходит вплоть до достижения нулевого значения, которое характеризует вступление популяции в стационарную фазу: X = X4

(для т, лежащих между т4 и т5).

По завершении фазы стационарного роста начинается фаза отмирания, или фаза дегенерации, культуры, характеризующаяся уменьшением численности популяции.

Приведенная выше система уравнений может быть использована только для описания конкретной кинетической кривой роста, полученной в результате эксперимента, но не в состоянии служить основой для прогнозирования процесса, так как в приведенных зависимостях в качестве параметров (Х1, …, Х4; т1, …, т5) вводятся конечные значения концентрации биомассы и времени. В настоящее время еще нет общепринятой математической модели роста популяции, которая достаточно точно описывала бы кинетику накопления биомассы в условиях периодического культивирования и содержала бы минимальное число эмпирических коэффициентов. В наибольшей степени этим требованиям отвечает модель Н. И. Кобозева, использование которой при изучении кинетики роста популяции дает обнадеживающие результаты. Интегральная форма предложенного им уравнения, описывающего кинетическую кривую роста популяции, имеет вид

Это уравнение является наиболее общим выражением для роста популяции, и в зависимости от частных условий (обратимое или необратимое размножение, рост популяции с исчерпыванием субстрата или при поддержании его количества на постоянном уровне) уравнение приобретает соответствующую форму и дает различное выражение для величины концентрации биомассы.

Основной недостаток периодического способа — цикличность и постоянное изменение условий культивирования, что затрудняет контроль и регулирование параметров процесса.

Большие возможности для повышения эффективности производства заложены в непрерывном способе выращивания.