Подготовка образца
Вне зависимости от применяемой методики окрашивания, существуют единые правила подготовки исследуемого объекта. Обязательными являются следующие стадии:
- Стерильными инструментами делается мазок на предметное стекло.
- Образец подсушивается. Это делается при комнатной температуре либо с использованием сушильных шкафов.
- Далее следует стадия фиксации – специальными составами микроорганизмы прикрепляются к стеклу.
- Собственно окрашивание – образец покрывается красителем на фиксированный период времени, после чего его смывают.
- Окончательная сушка – образец снова высушивается.
Для чего нужно окрашивание?
Бактерии представляют собой полупрозрачные микроорганизмы, которые преломляют световые лучи. Учитывая эти их свойства, при обычной микроскопии без применения окрашивания они не видны. Определение микробов в мазках может осуществляться различными видами микроскопии:
- аноптральная микроскопия;
- фазово-контрастная;
- в темном поле;
- с опущенным конденсором.
Однако наиболее информативным метод исследования морфологических и культуральных свойств возбудителя считается изучение тинкториальных свойств убитых и окрашенных микроорганизмов.
Для микроскопического исследования тинкториальных свойств применяются в основном анилиновые красящие вещества. Существует две разновидности этого метода определения тинкториальных свойств – с использованием простой или сложной окраски микроорганизмов.
- Для простой окраски необходимо использование одного красителя – она применяется при необходимости проведения обзорной микроскопии, когда выполняется определение типа взаиморасположения бактерий и их формы.
- Сложная окраска требует последовательного применения нескольких красителей. Она используется для определения химических веществ в составе структур клетки (цитохимическое исследование), изучения деталей строения микроорганизмов.
Грамположительные и грамотрицательные
Именно такие характеристики бактерий можно встретить в инструкциях к различным медицинским препаратам. Этот способ изучения тинкториальных свойств бактерий основан на использовании генциантового фиолетового красителя и фиксации йодом. Это методика Ганса Кристиана Грама, датского врача, который предложил ее в 1884 году. В результате такого окрашивания бактерии делятся на две группы:
- Грам (+) – окрашиваются в синий цвет (стафилококки и стрептококки).
- Грам (-) – окрашиваются в цвет от розового до красного (энтеробактерии, сальмонеллы, кишечные палочки).
Различный результат окрашивания получается из-за неодинаковых тинкториальных свойств стенок бактерий. Метод окраски Грама и сегодня является основным при диагностике некоторых инфекционных болезней.
Самые распространенные красители
Чаще всего используются красители на основе анилина с разными значениями кислотных показателей (рН). Большинство красителей – порошки, которые разводят в спирте.
Красители, в которых красящими агентами являются катионы, называются основными (рН больше 7). С их помощью можно окрасить микроорганизмы в красный (фуксин, сафранин), фиолетовый (метилвиолет, тионин), синий (метиленовая синь), зеленый (малахитовая зелень), коричневый (хризоидин) и черный (индулин) цвета.
Красители, в которых красящими агентами являются анионы, называются кислотными (рН меньше 7). Они покрасят образец в красный (эозин), желтый (пикрин) или черный (нигрозин) цвета.
Есть группа нейтральных красителей (например, родамин В), где красящими агентами выступают и катионы, и анионы.
Этиология
Staphylococcus aureus — основной представитель рода Staphylococcus семейства Micrococcaceae.
-
Морфология. Staphylococcus aureus – шаровидная бактерия, лишенная жгутиков и способная формировать микрокапсулы, которые защищают ее от повреждения и высыхания.
-
- Тинкториальные свойства. Стафилококки окрашиваются по Грамму в синий цвет. В мазке они располагаются хаотично, скоплениями или в виде гроздьев винограда.
- Культуральные свойства. Бактерии растут на питательных средах, содержащих соль, желток куриного яйца, молоко, кровь. Обычно в микробиологических лабораториях используют элективные среды — ЖСА, МЖСА и кровяной агар. Колонии золотистого стафилококка имеют желтый или кремовый оттенок благодаря пигменту-каротиноиду и радужный венчик по периферии.
- Биохимические свойства. Staphylococcus aureus сворачивает цитратную кроличью плазму, обладает лецитовителлазной активностью, расщепляет аэробный маннит.
- Физиологические свойства. Бактерии устойчивы к замораживанию, нагреванию, солнечным лучам и некоторых химикатам. Оптимальная температура для жизнедеятельности стафилококка – 30-37°C. Способность к размножению микроб сохраняет при 4-43°C. Бактерии сохраняют жизнеспособность и в более суровых условиях. Отличительное свойство стафилококка ауреус – способность выживать в растворе поваренной соли. Микроб быстро приспосабливается к воздействию антибиотиков и антисептиков. В организме здорового человека размножение стафилококка ауреус сдерживается клетками иммунной системы, лакто- и бифидобактериями.
- Патогенные свойства бактерии: адгезивность – прикрепление к клеткам макроорганизма, колонизация – размножение на этих клетках, инвазивность – проникновение внутрь клеток и продукция токсинов.
К факторам патогенности стафилококка ауреус относятся:
- Фибринолизин способствует проникновению микробов в кровь и развитию сепсиса.
- Гемолизины угнетают клеточный иммунитет и помогают стафилококкам выжить в очагах воспаления. Благодаря этим факторам инфекция может приобретать генерализированную форму.
- Эксфолиатин повреждает клетки кожи. Он поражает эпидермис, вызывая появление таких пузырьков, как при ожогах.
- Лейкоцитин разрушает лейкоциты — белые клетки крови.
- Энтеротоксин – ядовитое вещество, вырабатываемое стафилококками и вызывающее у человека пищевое отравление. Он провоцирует рвоту, боль в животе, диарею. Этот яд накапливается в пище и не разрушается при термической обработке.
- Коагулаза — фермент, свертывающий кровь. Плазмокоагулаза, продуцируемая Staphylococcus aureus, бывает двух видов: связанная с клеточной стенкой и свободная. Первая защищает микроб от фагоцитов, окружая барьером из свернувшейся крови, а вторая образует коагулазотромбин, вызывающий тромбообразование.
- Белок А, выделенный с поверхности клеточной стенки стафилококка ауреус, хорошо связывает иммуноглобулины класса G.
- Пенициллиназа защищает микроб от большинства пенициллиновых антибиотиков.
- Лидаза расплавляет кожные покровы и потовые железы, позволяя бактериям проникнуть вглубь организма.
- Эндотоксин, вырабатываемый микробом, приводит к развитию интоксикационного синдрома.
Устойчивость микробов к антибактериальным препаратам – проблема современной медицины. Отдельные штаммы Staphylococcus aureus приобретают резистентность к некоторым антибиотикам – цефалоспоринам и пенициллинам. Их называют метициллин-резистентными (MRSA). Антибиотикорезистентность обусловлена мутацией штаммов, произошедшей под давлением естественного отбора и наличием у стафилококка ауреус пенициллиназы — фермента, расщепляющего молекулу пенициллина. Метициллинрезистентные стафилококки очень важны в эпидемиологическом отношении.
