Генная инженерия [генетическая]

Вопросы, задачи и методы биотехнологий

Биотехнологии предназначены для получения заданных свойств у генетически измененного организма. Основным инструментом биотехнологий является генная инженерия. Она позволяет, используя методы молекулярного клонирования и горизонтального переноса, вносить изменения напрямую в генный аппарат клетки.

Способы изменения генома

Для того, чтобы микроорганизм приобрел нетипичные для него свойства, необходимо изменить его геном. Для этого существуют два пути:

• мутация – воздействие на клетку мутагенов (химические яды или излучение) приводит к неконтролируемым генетическим мутациям;
• прямое введение в геном нуклеотида с необходимыми свойствами.

Для генной инженерии технологическим решением проблемы введения нужного нуклеотида в микроорганизм стала бактериальная трансформация. Происходит внедрение донорской плазмиды в бактерию-реципиент, что является типичным горизонтальным переносом наследственной информации.

Плазмидные технологии решили вопрос введения искусственных генов в клетку микроорганизма. Одним из примеров успехов генной инженерии является производство инсулина человека, при котором используются генетически модифицированные бактерии.

Для изучения бактерий, геном которых подвергся изменению методами генной инженерии, используют следующие техники горизонтального переноса генной информации:

• нокаут гена – исследуемый участок ДНК удаляют или повреждают, после чего отслеживают результаты мутации;
• искусственная экспрессия – в клетку вводят новый ген, результаты мутации отслеживаются;

Для отслеживания продукта модификации генная инженерия использует метод визуализации. Для этого применяется флуоресцентный белок, что позволяет отслеживать процесс.

Другим способом генной инженерии является добавление к гену небольших по размеру олигопептидов (репортерный элемент), которые выявляются специфическими антителами.

Генная инженерия воздействует не только на строение молекулы ДНК. Она изучает экспрессию гена, которая напрямую связана с промотором (небольшой участок ДНК перед кодирующей областью) и фактором транскрипции (перенос наследственной информации).

Техниками генной инженерии в будущем будет возможно воздействовать не только на геном прокариотов, но и на геном человека. Методы генотерапии по воздействию на геном человека еще разрабатываются и проверяются на приматах. Методы горизонтального переноса наследственной информации помогут решить вопросы с генетическими заболеваниями.

Сегодня геном бактерии является удобным объектом генетических исследований. У растений, животных и человека совокупность всех наследственных факторов организма – геном – будет определять характерные признаки (генотип) клетки, а результат взаимодействия с окружающей средой – фенотип.

Изменения в сельском хозяйстве

Конец 80-х годов. Ученые успешно закончили эксперимент по внедрению генов. Десятки видов животных и растений стали объектами опытов. Удалось добиться высоких результатов. Растения стали устойчивыми к заморозкам, пестицидам и вирусам. Позже при помощи опытов в генно-инженерных лабораториях ученые внедрили в клетки томата, картофеля и хлопчатника гены земляной бактерии. Растения стали устойчивыми к воздействию грызунов. Сегодня ученые настолько далеко зашли в своих экспериментах, что могут создавать капусту, которая самостоятельно выделяет яд скорпиона для убийств насекомых, бананы, которые помогают излечить гепатит и иные заболевания и даже деревья, не подверженные негативным воздействиям. Однако употребление генно-модифицированной продукции в пищу грозит осложнениями и даже бесплодием, что скажется на следующих поколениях. Именно такой результат был получен после опытов, проведенных на мышах и крысах.

Снижаем риски: от ТРАНС к ЦИС и ниже

Сейчас прохождение всех тестов на биобезопасность и вывод на рынок генетически модифицированных организмов, в том числе растений, жестко регулируется на международном уровне. В этом вопросе правовая база ЕС опирается на директиву Европейского парламента и Совета Европейского союза от 12 марта 2001 г. «О преднамеренном выпуске в окружающую среду генетически модифицированных организмов». Примечательно, что данный нормативный документ исключает из перечня ГМО организмы, полученные путем скрещивания, экстракорпорального оплодотворения, полиплоидной индукции, возникновения мутаций и слияния протопластов скрещиваемых видов (соматическая гибридизация).

Законодательство РФ в области ГМО растительного происхождения регулируют 4 федеральных закона и 6 постановлений Правительства РФ, в том числе федеральный закон № 86-ФЗ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» от 5 июля 1996 г. Ожидается вступление в силу постановления, позволяющего узаконить возделывание ГМ-культур на территории России, которые пока можно выращивать только на опытных участках. Для ввоза в нашу страну сегодня разрешены 22 линии пищевых и кормовых ГМ-растений, среди которых кукуруза, картофель, соя, сахарная свекла и рис, а любые ГМО и ГМ-продукты должны проходить обязательную регистрацию.

В свою очередь, мировое ученое сообщество считает, что нужно различать ГМО по способу получения и делать послабления для продуктов, полученных умеренным вмешательством. Так появилась система деления ГМО на три вида: ТРАНС, ЦИС и ИНТРА.

Трансгенными сегодня называют организмы с искусственно введенными генами, которые в принципе не могут быть приобретены путем естественного скрещивания. Это могут быть гены растений других видов или животных, например рис, в геном которого встроен ген кукурузы. Потенциальная опасность трансгенных культур в том, что приобретенные таким образом новые качества могут повлиять на пригодность к использованию в пищевых или кормовых целях, а затем передаться диким родственникам, что может иметь непредсказуемые последствия для природных экосистем

По этой причине законодательные и регулирующие органы развитых стран уделяют большое внимание биобезопасности таких культур, чтобы снизить риск экологических сдвигов

В геном цисгенных растений могут быть введены гены организмов того же или близких видов, с которыми возможно скрещивание в естественных условиях. При этом сам целевой ген не должен быть видоизменен или оторван от своих регуляторных последовательностей. Пример цисгенного растения — картофель, не подверженный картофельной гнили благодаря встраиванию генов диких видов картофеля из Анд, устойчивых к этому заболеванию. Такой картофель сейчас создается в Бельгии (VIB’s fact series, 2015)

Важно, что цисгенезис не привносит в организм растения принципиально новых для него признаков и, по сути, аналогичен традиционному скрещиванию с родственными дикими формами

Интрагенезис можно считать продолжением концепции цисгенезиса, но в этом случае в ДНК растения встраивают его собственный ген, совмещенный с регуляторными участками других его генов. В ходе такой модификации искусственно создаются новые комбинации из уже имеющихся в растении участков ДНК (Holme, 2013). Подобное изменение регуляции активности генов позволяет усиливать полезные признаки (например, способность накапливать витамины в листьях) или, напротив, устранять или сводить к минимуму нежелательные.

Между тем при современном регулировании оборота ГМО-различия между трансгенными и цисгенными растениями не учитываются, хотя эти типы кардинально различаются. Из-за жестких рамок, установленных законодательством, получение и использование цисгенных растений серьезно затруднено, что может заблокировать или значительно отсрочить проведение дальнейших исследований по улучшению сортов сельскохозяйственных культур. Пока лишь в Канаде контроль за цисгенными растениями менее строг по сравнению с трансгенными (Schouten, 2006).

Практическое использование достижений генетики микроорганизмов и генная инженерия в микробиологии

Микробиология —

Генетика микроорганизмов

Развитие генетики, открывшей методы получения наследственно измененных форм микроорганизмов, расширило возможности использования микроорганизмов в сельскохозяйственном и промышленном производстве, а также в медицине. Основной из этих методов — это индуцированное получение мутантов воздействием различными мутагенами (излучениями и химическими веществами) на дикие, существующие в природе культуры микроорганизмов. Таким методом удается создать мутанты, которые дают в десятки и сотни раз большее количество ценных продуктов (антибиотиков, ферментов, витаминов, аминокислот и т. д.) по сравнению с дикими формами микроорганизмов.

Процесс получения высокопродуктивных штаммов микроорганизмов состоит из многих этапов. На культуру микроорганизма воздействуют различными мутагенными факторами с последующим отбором наиболее продуктивного штамма. Этот мутантный штамм может подвергнуться дальнейшему воздействию мутагенов и дальнейшему отбору еще более продуктивных мутантов. Часто из тысячи бесполезных мутантов отбирают только один высокопродуктивный штамм. В последние годы методом радиационного и химического мутагенеза микроорганизмов получено большое число промышленных штаммов микроорганизмов — продуцентов антибиотиков, ферментов, витаминов, ценных пищевых аминокислот, ростовых и других веществ.

Особенно широкие перспективы переделки наследственной природы организмов сулит развитие генной, или генетической, инженерии. Это раздел молекулярной генетики, который разрабатывает методы создания новых генетических структур, несущих заданную информацию, и способов их переноса в клетки прокариот и эукариот.

Полученные методом генной инженерии новые генетические молекулы представляют собой рекомбинантные ДНК, включающие два компонента — вектор (переносчик) и клонируемую «чужеродную» ДНК. Так как переносчик должен обладать свойствами репликона и обусловливать репликацию вновь созданной рекомбинантной ДНК, то в качестве вектора обычно используют такие репликоны, как плазмиды, умеренные фаги и вирусы животных. Все эти переносчики имеют циркулярно замкнутую структуру ДНК. Клонируемая ДНК — это фрагмент ДНК, который несет необходимый ген (или гены), контролирующий образование нужного вещества.

Имеются различные приемы получения рекомбинантных молекул ДНК. Наиболее простой из них сводится к обработке изолированных молекул ДНК-вектора и ДНК, несущей необходимый ген, ферментами рестриктазами (эндонуклеазы рестрикции), расщепляющими взятые молекулы ДНК в строго определенном месте с образованием однонитчатых комплементарных друг другу концов, так называемых липких концов. Это первый этап получения рекомбинантных ДНК — «разрезание» молекул ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции. Второй этап заключается в обработке полученных линейных молекул ДНК ферментом полинуклеотидлигазой, которая «сшивает» две разные молекулы в одну рекомбинантную ДНК. На третьем этапе рекомбинантные молекулы вводят в клетки тех или иных бактерий методом трансформации. На завершающем, четвертом, этапе проводят клонирование трансформированных клеток.

В настоящее время методом генной инженерии получены рекомбинантные молекулы ДНК, несущие информацию для образования таких важных веществ, как интерферон, инсулин, гормон роста человека и другие в клетках кишечной палочки (Е. coli). По-видимому, методом генной инженерии можно будет создать и такие бактерии, которые, потеряв свою болезнетворность, помогут выработать иммунитет против многих инфекционных болезней животных и человека. В промышленности, благодаря использованию генной инженерии, появятся высокопродуктивные микроорганизмы, создающие белки, ферменты, витамины, антибиотики, ростовые вещества и другие нужные продукты.

Будут получены новые сорта растений и породы животных, устойчивые к заболеваниям и наделенные особенно выгодными для сельского хозяйства свойствами.

Возможно, методом генной инженерии будут созданы растения, обладающие способностью к связыванию молекулярного азота атмосферы. Такие растения, вероятно, можно будет получить после введения в их геном генов от микроорганизмов, фиксирующих азот из воздуха.

Нет сомнения в том, что в связи с разработкой и совершенствованием методов генной инженерии, показавших возможность передачи не только естественных генов живых организмов, но и искусственно синтезированных, открываются блестящие перспективы для научно-технического прогресса не только в медицине и промышленности, но и в сельскохозяйственном производстве.

Польза генной инженерии для человека

С начала 90-х годов во многочисленных лабораториях мира проводятся опыты по изменению генов человека с целью предотвращения заболеваний. Ученые уже научились бороться некоторыми разновидностями рака, диабетом, анемией.

В ближайшее время специалисты рассчитывают добиться результатов в предотвращении врожденных отклонений. Планируется разработать способ корректировки генетического кода зародыша. Если удастся добиться таких результатов, то можно значительно улучшить физические и умственные способности человека, предотвратить развитие отклонений. Некоторые ученые даже считают, что в будущем удастся сделать человека бессмертным.

Сегодня ученые уже добились фантастических результатов. Они научились создавать котов путем клонирования, которые светятся в темноте, воспроизвели некоторые виды рыб, которые очень быстро растут, путем пересадки генов животных во фрукты и овощи удалось добиться быстрого созревания плодов большого размера. Среди достижений есть и эко-свинья, растения, которые устраняют загрязнения окружающей среды, куры, несущие лекарственные яйца и козы, плетущие паутину.

Рецепт ГМО: режь, исправляй, сшивай

Так как же сделать ГМО из обычного растения? Рецепт довольно прост. Возьмите геном растительной клетки и добавьте в него «генетическую конструкцию» — последовательность ДНК, кодирующую производство нужного белка. Доставить ген можно с помощью вектора — молекулы ДНК или РНК, способной «размножаться» и переносить чужеродный наследственный материал из клетки в клетку. Таким образом можно добавить сразу несколько генов, например, с помощью вектора на основе кольцевой бактериальной плазмиды.

На первый взгляд, все просто, если не задумываться о том, как вставить новый генный фрагмент именно в тот участок ДНК растительной клетки, который нам нужен. А ведь в этом и заключается самая сложная задача редактирования генома, результатом которого являются современные ГМО.

Для того, чтобы расщеплять молекулы ДНК в точно заданных участках, сначала стали использовать рестриктазы — ферменты-«ножницы», способные узнавать определенные последовательности нуклеотидов (строительных блоков ДНК). Функцию сшивки ДНК-цепи исполняли другие ферменты — ДНК-лигазы, призванные исправлять (репарировать) повреждения в структуре ДНК.

Сегодня, как и 30–40 лет назад, эти методы активно используют для получения новых вариантов бактериальных и вирусных геномов. А вот для успешной работы с геномами высших организмов (таких как растения, животные и мы с вами) этих инструментов оказалось недостаточно. Дело в том, что рестриктазы способны узнавать лишь короткие последовательности ДНК, что вполне достаточно для эффективного расщепления коротких ДНК-цепей бактерий, где такие участки встречаются нечасто. Но геномы высших организмов содержат огромное множество коротких последовательностей нуклеотидов, узнаваемых рестриктазами, поэтому «прицельность» метода оказывается очень плохой.

Для редактирования таких геномов пришлось создавать свои инструменты точечного воздействия на ДНК: сначала олигонуклеотид-направленный мутагенез растений, затем сайт-направленный мутагенез с использованием ферментов-нуклеаз с «цинковыми пальцами», TALENs-нуклеаз и даже мегануклеаз (Закиян, 2014; Daboussi, 2015). Но лишь с открытием в 2012–2013 гг. знаменитой технологии CRISPR/Cas9 ученые вплотную подошли к точному исправлению или редактированию генов и геномов (Cong, 2013). Возможность вносить контролируемые изменения в наследственную информацию живых клеток стала настоящим прорывом и повлекла за собой глобальные изменения в селекции.

Соматический Франкенштейн

Интересно то, что в мощной законодательной «обороне» против ГМО оказались бреши, появившиеся благодаря ряду парадоксов и допущений, которые на руку смелым селекционерам. Один из примеров — соматическая гибридизация. Другими словами, формирование новых форм растений путем комбинирования ядерных и других (митохондриальных и пластидных) генов при культивировании и слиянии обычных соматических клеток, составляющих ткань растения и не принимающих участия в половом размножении. Этот тип гибридизации растений достаточно широко распространен, при этом на территории ЕС такие соматические гибриды не считаются ГМО. Соответственно их оборот не подвергается строгому контролю.

Что же это за волшебный способ селекции? На первом этапе клетки растений двух разных видов (как правило, культурного и дикорастущего) обрабатывают специальными агентами, разрушающими клеточную оболочку, чтобы получить протопласты. Далее химическим или механическим способом провоцируют слипание и слияние протопластов, которые в дальнейшем восстанавливают общую клеточную оболочку. В результате из двух и более «родительских» клеток образуется новый живой организм — регенерант, или соматический гибрид.

Судьба родительских геномов при этом может быть различной. Два ядра могут синхронно делиться без слияния, образуя двуядерные дочерние клетки. Если же они сольются во время митотического деления, то в итоге получатся устойчивые одноядерные дочерние клетки, несущие смешанный генетический материал. Что касается внеядерного генома, то он тоже может быть получен как от одного родителя, так и быть смешанным. С помощью соматической гибридизации можно получать самые разные гибриды, включая такие, создание которых в принципе невозможно половым путем: например, гибриды, несущие цитоплазматические гены не от материнского растения, а от обоих родителей; «цибриды», содержащие ядро от одного из родителей, а цитоплазму от другого, и др.

Использование соматических клеток при гибридизации позволяет успешно работать с отдаленными, обычно нескрещиваемыми видами и полностью стерильными растениями. Иными словами, этот метод используют, если возникает необходимость преодолеть несовместимость культурных и дикорастущих видов. Таким способом можно получать межклассовые гибридные клеточные колонии: рис + соя, ячмень + табак и даже табак + мышь (Makonkawkeyoon, 1995)! Правда, большинство таких регенерантов сами размножаться уже не способны, а иногда и вовсе представляют собой скорее скопление клеток, чем полноценный организм.

Интересно, что, хотя метод соматической гибридизации влечет за собой значительную «перетасовку» генов, а его результаты очень непредсказуемы, он, тем не менее, разрешен для использования в сельском хозяйстве, в отличие от методов направленного мутагенеза. Как говорила Алиса в Стране чудес, «чем дальше, тем страньше».

Генная инженерия человека

В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.

Задача изменения генома взрослого человека несколько сложнее, чем выведение новых генноинженерных пород животных, поскольку в данном случае требуется изменить геном многочисленных клеток уже сформировавшегося организма, а не одной лишь яйцеклетки-зародыша. Для этого предлагается использовать вирусные частицы в качестве вектора. Вирусные частицы способны проникать в значительный процент клеток взрослого человека, встраивая в них свою наследственную информацию; возможно контролируемое размножение вирусных частиц в организме. При этом для уменьшения побочных эффектов учёные стараются избегать внедрения генноинженерных ДНК в клетки половых органов, тем самым избегая воздействия на будущих потомков пациента. Также стоит отметить значительную критику этой технологии в СМИ: разработка генноинженерных вирусов воспринимается многими как угроза для всего человечества.

С помощью генотерапии в будущем возможно изменение генома человека. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах. Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генноинженерных вирусных векторов для излечения взрослого самца обезьяны от дальтонизма. В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат (выращенный из модифицированной яйцеклетки) — обыкновенная игрунка (Callithrix jacchus).

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.

Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем. В 2016 в США группа учёных получила одобрение на клинические испытания метода лечения рака с помощью собственных иммунных клеток пациента, подвергаемых генной модификации с применением технологии CRISPR/Cas9.

В конце 2018 года в Китае родились двое детей, геном которых был искусственно изменён (выключен ген CCR5) на стадии эмбриона методом CRISPR/Cas9, в рамках исследований, проводимых с 2016 года по борьбе с ВИЧ. Один из родителей (отец) был ВИЧ-инфицированным, а дети, по заявлению, родились здоровыми. Поскольку эксперимент был несанкционированным (до этого все подобные эксперименты на человеческом эмбрионе разрешались только на ранних стадиях развития с последующим уничтожением экспериментального материала, то есть без имплантации эмбриона в матку и рождением детей), ответственный за него учёный не предоставил доказательств своим заявлениям, которые были сделаны на международной конференции по редактированию генома. В конце января 2019 года властями Китая были официально подтверждены факты проведения данного эксперимента. Тем временем учёному было запрещено заниматься научной деятельностью и он был арестован.

Воздействие окружающей среды

Результатом взаимодействие генотипа с окружающей средой является фенотип, который представляет собой модификационные изменения под конкретные условия среды обитания. При этом геном бактерии не изменяется.

Хотя фенотип зависит от конкретных внешних условий, все изменения контролируются геномом бактерии, так как возможные изменения определяются набором имеющихся наследственных материалов. Способность изменяться является инструментом эволюции, позволяющим решать вопросы естественного и искусственного отбора.

Изменчивость фенотипа микроорганизма в зависимости от механизма воздействия, может быть:

• ненаследственной – с изменениями только фенотипа микроорганизма;
• наследственной – изменения происходят на уровне генотипа.

В микробиологии основными видами ненаследственных изменений фенотипа считаются:

• адаптация – ненаследственная приспособленческая реакция клетки;
• модификация – изменение внешних признаков бактерий (размер, форма или цвет колоний) под воздействием окружающих условий.

Модификация как изменение фенотипа представляет собой результат воздействия фактора окружающей среду. Основные характеристики модификационной изменчивости генома микроорганизмов:

• обратимость изменений фенотипа (касается как человека, так и бактерии) – изменение условий жизнедеятельности приведет к исчезновению существующей модификации и замене их на другие;
• изменения носят не индивидуальный, а групповой характер;
• изменения фенотипа не наследуются;
• модификация фенотипа происходит при каждом изменении условий жизни, при этом генотип остается неизменным.