Окраска микроорганизмов

Методы окраски препаратов. Окраска по методу Синева и метиленовым синим

В лаборатории применяются анилиновые краски, приготавливаемые из анилина и других производных каменноугольного дегтя. Для окраски препаратов применяются основные и кислые краски. Основные краски хорошо воспринимаются микробами и ядерным хроматином. Кислые краски хорошо окрашивают протоплазму и слабее микроорганизмы.

Кислыми красителями называются свободные окрашенные кислоты или соли этих кислот, обычно соли натрия. Основные красители — это соли красящих оснований, чаще всего хлоргидраты.

Насыщенные спиртовые растворы красок, из которых готовят рабочие краски, хранят в стеклянных банках с притертой пробкой.

Изготовление растворов заключается в следующем.

В флакон с притертой пробкой насыпают 10 г сухой краски, наливают 100 мл 96° спирта ректификата и при ежедневном взбалтывании оставляют раствор на несколько дней, после чего эта краска может быть употреблена для спирто-водных растворов, необходимых для окраски препаратов.

Наиболее часто употребляющиеся растворы красок:

Разведенный фуксин (фуксин Пфейффера)

10 мл карболового фуксина Циля, 90 мл дистиллированной воды. Этот раствор при хранении портится, поэтому его готовят по мере надобности и хранят не более суток.

Карболовый раствор кристалл-виолета

Краски — 1 г Спирта ректификата 96°— 10 мл Кристаллической карболовой кислоты — 2 г Дистиллированной воды — 100 мл

Краску растирают с карболовой кислотой, добавляя спирт, а потом дистиллированную воду, через сутки фильтруют.

Примечание. Вместо кристалл-виолета можно пользоваться насыщенными растворами метил-виолета либо генцианвиолета. Последний при окрашивании выпадет в осадок, в практике он менее применим.

Окраска по методу Синева

Для окраски применяются кусочки фильтровальной бумаги, пропитанные спиртовым раствором краски. Листы фильтровальной бумаги, разложенные на стекле, обливают 1—2% раствором (в 96° спирте) краски и затем окрашенную высушенную бумагу разрезают на кусочки размером 2X4 см и сохраняют в стеклянных темных банках с притертой пробкой. Приготовленные таким способом бумажки не теряют окрашивающих свойств весьма продолжительное время. Приготовленные препараты красятся в зависимости от исследуемого материала простым либо сложным методом.

К простому методу относится: окраска разведенным фуксином (фуксином Пфейффера), окраска щелочной метиленовой синькой. Окраска разведенным фуксином. На приготовленный на предметном стекле фиксированный на пламени и остывший исследуемый препарат наливают на 1—2 минуты разведенный фуксин. Затем препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Окрашивание метиленовой синькой. На приготовленный, высушенный и фиксированный мазок наливают пипеткой метиленовую синьку на 2—3 минуты, после чего препарат смывают водой и высушивают.

Ядра при этом окрашивании более интенсивно воспринимают окраску и резко выделяются над протоплазмой, которая окрашивается слабее.

К сложным методам окраски относятся окрашивания одного и того же препарата растворами нескольких красок в определенном порядке для дифференциации микробов вследствие их сродства к определенным краскам.

В число сложных методов входят: окраска кислотоустойчивых микробов по Циль-Нильсену, окраска по Граму, окраска па Романовскому-Гимза и другие.

— Читать далее «Окраска кислотоустойчивых микробов. Окраска микробов по Граму»

Оглавление темы «Микроскопия и подготовка препаратов к микроскопии»: 1.

Микроскопическое исследование. Подготовка материала для микроскопического исследования2. Темнопольная микроскопия. Техника темнопольной микроскопии3. Фазово-контрастная микроскопия. Техника фазово-контрастной микроскопии4. Подготовка материала для электронной микроскопии.

Подготовка материала к окраске5. Методы окраски препаратов. Окраска по методу Синева и метиленовым синим6. Окраска кислотоустойчивых микробов. Окраска микробов по Граму7. Окраска по Романовскому-Гимза. Окраска спор8. Приготовление питательных сред. Требования к питательным средам9. Взятие малых количеств крови. Как брать кровь из пальца для исследований?10. Приготовление мазков крови.

Взятие крови для определения СОЭ

1 2   3   4   5   6   7   8   9   …   40

ОКРАСКА КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ БАКТЕРИЙ ПО ЦИЛЮ-НИЛЬСЕНУ.

Кислотоустойчивые бактерии отличаются высоким содержанием липидов в кле­точной стенке. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной кра­ситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечи­ваются кислотой и окрашиваются дополнительным красителем. .

Mycobacterium tuberculosis в мокроте больного. Окраска по Цилю-Нильсену. Увеличение х___________________

ОКРАСКА СПОР ПО ОЖЕШКО.

Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители.

Окраска по Ожешко. Увеличение х_

ОКРАСКА ВОЛЮТИНА ПО НЕИССЕРУ.

При окраске метиленовым синим образуется нерастворимый в воде комплекс: кра­ситель + волютин. При промывке водой тело микробной клетки обесцвечивается, а гранулы волютина сохраняют синюю окраску. Тело клетки затем докрашивается везувином в желтый цвет.

Corynebacterium diphtheriae. Окраска по Нейссеру. Увеличение х_

БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ

Бактериоскопический метод диагностики -______________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________

Метод используется для диагностики заболеваний, возбудители которых обладают характерными морфологическими, тинкториальными свойствами и типичной ло­кализацией в организме. Например: гонорея, сифилис, возвратные тифы, туберку­лез, некоторые микозы.

Грам (+) и Грам (-) представители и их воздействие на организм

Итак, клеточная стенка грамположительных бактерий имеет лишь один слой. Единственное исключение, известное в современной микробиологии, – Deinococcus-Thermus. Несмотря на наличие защитной мембраны, при проведении теста она хорошо окрашивается в синий цвет.

Основными представителями Грам (+) бактерий являются:

1. Кокковые или шаровидные (кроме протеобактерий Neisseria):
   • стафилококк, провоцирующий сепсис крови и гнойные высыпания на коже;
   • стрептококк, ведущий к развитию ревматизма и тонзиллитов;
2. Палочковидные:
   • фирмикуты, служащие источником сибирской язвы и токсических инфекций;
   • клостридии, как возбудители столбняка и ботулизма;
   • листерия, заражение которой приводит к воспалению мозга.
3. Булавовидные:

Грамотрицательные бактерии, более устойчивые к антителам за счет дополнительной мембраны, представлены такими разновидностями:

1. Спиралевидные:
   • спирохеты, которые являются возбудителями лептоспироза, возвратного тифа и сифилиса;
   • спириллы, вызывающие содоку – лихорадкоподобное состояние.
2. Палочки:
   • риккетсии, чей главной характеристикой служит внутриклеточный паразитизм;
   • хламидии – без лечения могут развиться ЗППП, конъюнктивит, пневмония.

Алгоритм окраски по Ожешко;

Алгоритм окраски по Бурри-Гинсу

Морфологические значения клетки

1. На предметное стекло (ближе к узкому краю) нанести каплю черной туши, разведенной в 10 раз.

2. В нее внести каплю культуры, перемешать две капли

3. Ребром шлифовального стекла сделать мазок, так же как и мазок крови

4. Высушить на воздухе

5. Зафиксировать химическим способом

6

Осторожно промыть водой. 7

Окрасить фуксином Пфейффера — 3-5 минут

7. Окрасить фуксином Пфейффера — 3-5 минут

8

Осторожно промыть водой, высушить на воздухе

Фильтровальной бумагой для высушивания препарата не пользоваться, не повредить препарат.

Микроскопия иммерсионная. Видим: фон препарата черный, клетки красные, капсулы не окрашены, в виде бесцветного ореола вокруг клетки.

1. На высушенный на воздухе мазок налить несколько капель 0,5% р-ра хлороводородной кислоты.

2. Подогреть до образования паров

3. Высушить и зафиксировать над пламенем спиртовки

4. Фиксировать препарат покрыть фильтровальной бумагой и нанести фуксин Циля

5. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогреть над пламенем спиртовки до отхождения паров. Добавляя красителя подогреть 2-3 раза

6. После охлаждения препарата снять бумажку и промыть водой.

7. Препарат обесцветить 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в раствор

8. Промыть водой

9. Окрасить водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-4 минут

10. Промыть водой, высушить

11. Микроскопия иммерсионная. Споры — красные, клетки — синие.

Окраска спор по методу Ожешко

1. На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор хло­ристоводородной кислоты и подогреть в течение 2—3 мин на пламени.

2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем.

3. Окрасить по методу Циля—Нильсена.

Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы — синий (рис. 2.2.3; на вклейке). Споры бактерий име­ют многослойную клеточную стенку сложного строения, прак­тически непроницаемую для красителей, поэтому для повыше­ния их тинкториальных свойств используют более жесткие условия протравливания, чем для окрашивания кислотоустой­чивых бактерий.

Окраска спор по методу Шеффера—Фултона

1. На фиксированный мазок нанести 5 % раствор мала­хитового зеленого и 3—4 раза нагреть до появления паров.

2. Промыть водой.

3. Докрасить 0,5 % сафранином в течение 30 с.

4. Промыть водой, высушить и микроскопировать. Споры бактерий окрашиваются в зеленый цвет, вегетатив­ ные клетки — в красный.

185.238.139.36 studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock! и обновите страницу (F5)очень нужно

Метод Бурри

Техника. Каплю исследуемой культуры смешивают на пред­метном стекле с каплей туши, затем с помощью другого стекла, поставленного к первому под углом в 45, делают тон­кий мазок по принципу приготовления мазков из крови.

Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют нефиксированным.

При использовании раствора конго рот после высушива­ния мазок обрабатывают 1% раствором соляной кислоты в аб­солютном алкоголе, затем высушивают и микроскопируют.

Микроскопическая картина: на окрашенном фоне ясно видны неокрашенные светлые микробные клетки.

ОКРАСКА ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

В микробиологической работе наиболее употребительны способы окраски фиксированных микроскопических препаратов, кото­рые в основном можно разделить на две группы: ориентировоч­ные, или простые, и дифференциальные, выявляющие химические и структурные особенности того или иного вида микроорганизма.

Простые методы окраски микробов

Простые методы окраски препаратов предполагают использование одного анилинового красителя и позволяют изучить такие морфологические признаки микроорганизма, как форму, размеры, расположение в мазке. Для этих целей используется ряд красителей: метилено­вый синий, фуксин и др.

Окраска разведенным карболовым фук­сином

Техника. На зафиксированный мазок наносят фуксин Циля, разведенный непосредственно перед окраской, дистилли­рованной водой в соотношении 1:10. Выдерживают 1-2 минуты, после чего смывают водопроводной водой, высушивают и микро­скопируют.

Микроскопическая картина. Все клетки равномерно окра­шиваются в розово-красный цвет.Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии

Препараты для люминесцентной микроскопии готовят так же, как для световой.

Это относится и к их фик­сации. Окраска препаратов отличается тем, что для люми­несцентной микроскопии применяют специальные красители – флуорохромы. Их отличительная особенность – способность све­титься под воздействием ультрафиолетовых и сине-фиолетовых лучей. Среди флуорохромов встречаются самые разнообразные органические вещества. Для окраски микроскопических препаратов применяют очень слабо концентрированные (1:500-1:100000) растворы флуорохромов.

Растворы готовят на дистиллированной воде, изотоническом растворе хлорида натрия или буферных смесях и хранят в тем­ной склянке, избегая действия света.

Нарисуем невидимое, или Методы окраски микроорганизмов

Мы живем в мире бактерий. Они вокруг нас и внутри нашего организма. Не удивительно, что мы хотим знать о них как можно больше. Но как рассмотреть и тем более изучить что-то настолько маленькое? Микроскоп, казалось бы, должен решить эту проблему. Но не все так просто – в своем естественном состоянии микроорганизмы прозрачны как стекло. «Проявить» картинку помогают различные методы окраски бактерий, помогающие исследовать внешнее и внутреннее строение микробов.

Как все начиналось

В конце девятнадцатого века датский биолог Кристиан Грам предложил решение этой проблемы. Если что-то невидимо, его нужно покрасить и посмотреть, что получится. Метод окраски бактерий, предложенный Грамом, был настолько убедителен, что и по сей день микроорганизмы разделяют на грамположительные (удерживающие окраску) и грамотрицательные (обесцвечивающиеся после обработки спиртом).

Старый – не значит плохой

Пожалуй, самый практичный и широко применяемый способ окрашивания микроорганизмов – метод Грама. Мазок, зафиксированный огнем, покрывают метиловым фиолетовым красителем, фиксируют йодом, просушивают и промывают спиртом. На этом этапе, в зависимости от свойств клеточной мембраны, бактерии становятся:

• ярко-синими (грамположительные);
• бесцветными (грамотрицательные).

Витальные методы окраски

По состоянию исследуемых организмов в микробиологии существуют:

• витальный способ, т. е. работа с живыми бактериями (опасен, требует строгого соблюдения техники безопасности);
• поствитальный метод – работа с фиксированными (убитыми) клетками;
• негативный, может быть витальным и поствитальным, удобен для работы с капсулами.

Работа с фиксированными препаратами

Белым по черному

Еще одна разновидность окраски бактерий основана на свойствах негатива, т. е. на темном фоне препарата четко видны бесцветные бактерии, иными словами, окрашивается среда, а не сам организм.

Иногда бактерии, попадая в определенные условия, образуют капсулы. Это слизистые образования, покрывающие клетку, чем-то похожие на гель. Капсулы прозрачны, их химический состав может сильно отличаться у разных видов бактерий, т.е. просто покрасить и оценить результат по получившемуся цвету не выйдет.

Окраска спорообразующих бактерий

Если говорить о клеточных оболочках, то нельзя не вспомнить о спорообразующих бактериях. Споры образуются при неблагоприятных для клетки условиях и могут существовать в агрессивной среде довольно длительное время. То, что хорошо для сохранения клетки, плохо для ее изучения. Споры очень плотные и почти не пропускают жидкости, кроме того, они кислотоустойчивы. Следовательно, простое окрашивание или метод Грама оставят споры бесцветными.

Как рассмотреть бактериальные жгутики

Еще одна непростая задача – окраска бактерий со жгутиками. Это спирально закрученные очень тонкие нити, которые микроорганизмы используют для перемещения. Жгутики необычайно тонкие, при окрашивании они легко отрываются от клетки. Поэтому перед началом окрашивания жгутики протравливают, искусственно увеличивая в объеме.

Техника окрашивания

Для получения окрашенного препарата нельзя просто взять кисточку, краски и отловить бактерию. Существует определенная схема работы с микроорганизмами:

1. Приготовление мазка. На предметное стекло (стерильное) наносят каплю воды, в которую затем бактериологической петлей вносят и распределяют по поверхности лабораторный материал.
2. Высушивание. Лишняя жидкость высушивается либо естественным путем при комнатной температуре, либо мазок немного прогревается высоко над пламенем горелки.
3. Фиксация. Мало просто убрать воду, нужно закрепить бактерии на предметном стекле. Для этого можно использовать огонь (несколько проходов над самой горячей частью пламени) или жидкость (спирт, ацетон). После такой обработки микроорганизмы быстрее впитывают краску.
4. Непосредственно окрашивание. Краска должна полностью покрывать всю поверхность мазка. Выдержав нужное время (для каждого красителя свое), краску убирают и промывают препарат водой.